T7 RNA Polymerase定量檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)
預期用途
本試劑盒應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測T7 RNA Polymerase的殘留。
檢測原理
T7 RNA Polymerase (T7 RNA聚合酶 )為重組E.coli表達的噬菌體T7 DNA編碼的蛋白，是一種高度特異性識別T7啟動子序列的DNA依賴的5'→3' RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶可以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA或雙鏈DNA模板鏈互補的RNA 。
本試劑盒應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法 (夾心ELISA)檢測T7 RNA Polymerase的含量，用抗T7 RNA Polymerase的單克隆抗體包被酶標板，形成固相抗體，向固相抗體微孔板中加入T7 RNA Polymerase校準品和待測樣品，經(jīng)過洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的酶標試劑，形成 “包被抗體 -抗原 -酶標檢測抗體 ”復合物，經(jīng)過洗滌后加入顯色液顯色，顯色液在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色，顏色的深淺與樣品中T7 RNA Polymerase的量呈正相關(guān)。
主要組成成分
| 組分 | 蓋色 | DD3504-01 | |
| BOX1 | T7 RNA Polymerase校準品(8,000 ng/ml) | 紅色 | 100 μl |
| BOX2 | 預制酶標板 (包被anti-T7 RNA Polymerase的單克隆抗體 ) | - | 12 × 8孔，96孔 |
| 樣品稀釋液 | - | 30 ml × 2 | |
| 濃縮洗滌液(20 ×) | - | 30 ml | |
| 酶標試劑稀釋液 | - | 12 ml | |
| 酶標試劑(100 ×) | 透明 | 120 μl | |
| 顯色液 | - | 12 ml | |
| 終止液 | - | 6 ml | |
| 封板膜 | - | 3張 | |
| 說明書 | - | 1冊 |
說明：本試劑盒不可與其他商品化試劑盒混用。
需要但是未提供的試劑與耗材：
>去離子水或蒸餾水
>振蕩器
>洗板機
>微量移液器與配套滅菌槍頭
>恒溫箱或水浴鍋
>酶標儀
>加樣槽
>吸水紙
儲存條件及有效期
1、BOX1于-30 ～ -15℃儲存，避免強光直射，有效期12個月；
BOX2于2 ～ 8℃儲存，避免強光直射，有效期12個月。
2、包被條拆封使用后，應將剩余包被條密封，在2 ～ 8℃儲存，在有效期內(nèi)使用。
3、BOX 1使用后要及時放回到-30 ～ -15℃儲存，避免反復凍融，在有效期內(nèi)使用。
4、BOX 2其他組分使用后要及時放回到2 ～ 8℃條件，在有效期內(nèi)使用。
5、產(chǎn)品批號及失效日期：見產(chǎn)品外包裝標簽。
檢驗方法
1、實驗前準備
(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，校準品從冷凍環(huán)境中取出，放置室溫(18 ～ 28℃)平衡至少 30 min。
(2)1 ×洗滌液配制：將濃縮洗滌液(20 ×)用去離子水或蒸餾水20倍稀釋，混勻備用。例如30 ml濃縮洗滌液(20 ×)用570 ml去離子水或蒸餾水稀釋。
(3)校準品的配制：取校準品原液(8,000 ng/ml)稀釋100倍后為80 ng/ml的濃度，然后再稀釋5倍為校準品的第一個點(16 ng/ml)，再2倍倍比稀釋成8、4、2、1、0.5 ng/ml。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新配制的校準品溶液。
▲標準品初次使用后請分裝保存
| 移取 | 加入至 | 配成T7 RNA Polymerase校準品濃度 |
| 10 μl的8,000 ng/ml的校準品 | 990 μl的樣品稀釋液 | 80 ng/ml |
| 500 μl的80 ng/ml的校準品 | 800 μl的樣品稀釋液 | 16 ng/ml |
| 500 μl的16 ng/ml的校準品 | 500 μl的樣品稀釋液 | 8 ng/ml |
| 500 μl的8 ng/ml的校準品 | 500 μl的樣品稀釋液 | 4 ng/ml |
| 500 μl的4 ng/ml的校準品 | 500 μl的樣品稀釋液 | 2 ng/ml |
| 500 μl的2 ng/ml的校準品 | 500 μl的樣品稀釋液 | 1 ng/ml |
| 500 μl的1 ng/ml的校準品 | 500 μl的樣品稀釋液 | 0.5 ng/ml |
| 500 μl的樣品稀釋液 | 空管(對照孔) | 0 ng/ml |
(4)1 ×酶標試劑的配制：將酶標試劑(100 ×)用酶標試劑稀釋液稀釋成1 ×酶標試劑，根據(jù)檢測數(shù)確定稀釋體積(每孔100 μl)，例如檢測整板，理論需要10 ml，實際配制11 ml 1 ×酶標試劑，其他情況根據(jù)所需檢測數(shù)理論用量，增量10%配制。
2、實驗步驟
(1)加樣：先在酶標板中每孔加入100 μl樣品/校準品。
▲待測樣品需用樣品稀釋液至少稀釋5倍。
(2)孵育：用封板膜封板后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h。
(3)洗板：孵育完成后，小心揭去封板膜，棄掉孔內(nèi)液體，每孔至少加入300 μl 1 ×洗滌液，靜置浸泡30 s，連續(xù)洗板4次，最后一次盡量去除殘留液體。
(4)加酶標試劑：以每孔100 μl加樣量加入1 ×酶標試劑。
(5)重復步驟2、3。
(6)顯色：按每孔100 μl加樣量將顯色液加入酶標板，用封板膜封板后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育15 min。
(7)終止/讀值：每孔加入50 μl終止液，輕輕混勻后即可用酶標儀檢測各孔在450 nm單波長處OD值。
簡明操作程序
質(zhì)量控制
檢測時，校準曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，否則實驗無效。
結(jié)果計算
(1)校準品和樣品孔測得的OD值扣除對照孔的OD值用于結(jié)果計算。
(2)取以10為底校準品濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，采用四參數(shù)方式擬合繪制校準曲線。如有設置復孔，則應取其平均值計算。
(3)將樣品的OD值扣除對照孔的OD值代入校準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，即為樣品的實際濃度。最低定量限(LOQ)=0.5 ng/ml，低于0.5 ng/ml報告為<0.5 ng/ml。若樣品OD值高于校準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。此校準曲線僅用于示范，每次實驗均應生成新的校準曲線。
產(chǎn)品性能指標
1、靈敏度
| LOD | LOQ |
| 100 pg/ml | 0.5 ng/ml |
2、精密度
| 分析內(nèi)精密度 | 分析間精密度 | |||||
| 樣品 | 批次1 | 批次2 | 批次3 | 操作者1 | 操作者2 | 操作者3 |
| n | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 平均值 | 2.3295 | 1.9380 | 1.8819 | 2.2142 | 2.1607 | 2.2902 |
| SD | 0.0827 | 0.0828 | 0.0394 | 0.1085 | 0.0721 | 0.1494 |
| CV | 4% | 4% | 2% | 5% | 3% | 7% |
3、回收率
| 樣品(n=3) | 測得濃度平均(ng/ml) | 測得濃度平均(ng/ml) | 平均回收率% | 回收率范圍% |
| 高 | 8.6875 | 9.0643 | 105 | 101 - 110 |
| 9.0066 | ||||
| 9.4987 | ||||
| 中 | 1.9855 | 2.0072 | 91 | 90 - 92 |
| 2.0027 | ||||
| 2.0334 | ||||
| 低 | 0.7118 | 0.7461 | 102 | 97 - 111 |
| 0.8122 | ||||
| 0.7144 |
注意事項
(1)操作前仔細閱讀使用說明書，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。
(2)避免在惡劣的環(huán)境(如含有84消毒液、次氯酸鈉、酸堿或乙醛等高濃度腐蝕性氣體及灰塵的環(huán)境)條件下進行實驗，實驗室消毒應在實驗結(jié)束后進行。
(3)試劑盒應平衡至室溫下方可打開使用，試劑使用前應充分搖勻。各組分儲存與用法請嚴格按照使用說明，切勿自行更改與稀釋。在使用前，請嚴格檢查試劑盒的效期與包裝。如果效期超時或包裝破損，請不要用于實驗操作。試劑在有效期內(nèi)使用后，剩余試劑要及時密封，參照說明書進行保存。
(4)預制酶標板可拆卸，每次將需用數(shù)量的板條取出后，其余未用板條須放回鋁箔袋內(nèi)于2 ～ 8℃儲存待用。拆卸板條時，切勿碰觸孔底，以免指紋、刮痕等影響之后的讀值。洗板后，切勿放置太久避免酶標板干燥失活，需立即進行下一步操作。
(5)加樣品時，避免產(chǎn)生氣泡，避免槍頭觸及板底，造成刮痕影響讀值。
(6)封板膜不可重復使用。不同批號的試劑組分不可混用，微量移液器槍頭不可混用，以免交叉污染。
(7)若濃縮洗滌液出現(xiàn)結(jié)晶，應置于37℃中至溶解后再使用。洗滌時各孔需加滿洗液，以防止孔口有殘留試劑未被洗干凈。洗滌要徹底。加液時不可用力過猛，避免串流。每次洗滌均應甩干孔內(nèi)液體，最后應將孔內(nèi)液體拍干(洗板推薦使用洗板機)。
(8)請在反應終止后15 min內(nèi)進行。
(9)操作中須佩戴一次性手套和實驗室規(guī)定的防護物品，檢測后的廢液和用具須按照當?shù)卣陀嘘P(guān)國家規(guī)定進行無害化處理。
(10)本產(chǎn)品僅供科學研究使用，不得用于臨床醫(yī)學診斷及其他非合理用途。
